Главная » 2014»Июль»27 » Скачать Адсорбция биологических частиц(вирусов) на функционализированной поверхности полимерных сорбентов монолитного типа. Калашникова, бесплатно
21:19
Скачать Адсорбция биологических частиц(вирусов) на функционализированной поверхности полимерных сорбентов монолитного типа. Калашникова, бесплатно
Адсорбция биологических частиц(вирусов) на функционализированной поверхности полимерных сорбентов монолитного типа
Диссертация
Автор: Калашникова, Ирина Васильевна
Название: Адсорбция биологических частиц(вирусов) на функционализированной поверхности полимерных сорбентов монолитного типа
Справка: Калашникова, Ирина Васильевна. Адсорбция биологических частиц(вирусов) на функционализированной поверхности полимерных сорбентов монолитного типа : диссертация кандидата химических наук : 02.00.06 / Калашникова Ирина Васильевна; [Место защиты: Ин-т высокомолекуляр. соединений] - Санкт-Петербург, 2008 - Количество страниц: 169 с. ил. Санкт-Петербург, 2008 169 c. :
Объем: 169 стр.
Информация: Санкт-Петербург, 2008
Содержание:
Список сокращений
Введение
Глава 1 Обзор литературы
11 Высокомолекулярные соединения и их разнообразие
111 Вирусы: структура, функции, применение
112 Конструирование модельных биосистем на основе синтетических и природных полимеров
1121 Формирование конъюгатов
1122 Липосомальные структуры
1123 Полимерные частицы как субстрат для конструирования модельных биосистем
12 Хроматография как эффективный метод выделения и исследования вирусов
121 Особенности хроматографии вирусов
122 Основные типы хроматографии, используемые для разделения вирусов
1221 Гель-проникающая хроматография
1222 Ионообменная хроматография
1223 Аффинная и псевдо-аффинпая хроматография
13 Монолитные маркопористые сорбенты и особенности хроматографического разделения с их использованием
131 Синтез и морфология монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов
132 Гидродинамика и массоперенос в проточных монолитах
14 Практическое приложение принципа биологической комплементарности
141 Аффинная хроматография
1411 Высокоэффективная аффинная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках)
1412 Выбор аффинного лиганда
1413 Роль промежуточных спейсеров
1414 Способы ковалентного введения в структуру поверхности носителя биоаффинных лигапдов
14141 Модификация и активация и поверхностных групп сорбентов
142 Биологические тест-системы
1421 Планшетные диагностикумы
1422 Многоканальные диагностические линейки (биочипы)
14221 Материалы, используемые для создания непроточных матриц (двумерные и трехмерные биочипы)
14222 Методы количественного детектирования зон анализируемых веществ
Глава 2 Результаты и обсуждение
21 Конструирование физико-химических моделей вирусов
22 Исследование динамической адсорбции модельных частиц методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках
221 Ионообменная хроматография модельных частиц
222 Поведение вирусоподобных частиц в условиях биоаффинной адсорбции на поверхности монолитных фаз
223 In vitro моделирование взаимодействий вирус-клетка
224 Разработка стратегии эффективного метода выделения и очистки вируса гриппа А с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах
225 Диагностика вирусов гриппа А и В с использованием ГМА-ЭДМА монолитного сорбента в виде непроточных слоев (биочипов)
2251 Разработка алгоритма диагностики на чипе на примере модельных частиц
2252 Обнаружение вирусов гриппа в биологических образцах с использованием разработанной тест-системы на основе биочипов
Глава 3 Экспериментальная часть
31 Материалы
32 Оборудование
33 Методы
331 Конструирование моделей вирусов
332 Высокоэффективная монолитная дисковая хроматография (ВЭМДХ)
3321 Ионообменная хроматография
3322 Высокоэффективная монолитная дисковая аффинная хроматография (ВЭМ-ДАХ)
33221 Подготовка аффинных сорбентов на основе монолитных дисков
33222 ВЭМДАХ модельных вирусоподобных частиц
3323 Псевдо-аффинный вариант ВЭМДХ
333 Тест-системы на основе ГМА-ЭМА непроточных слоев
3331 Количественный анализ содержания белка и вирусоподобных частиц в модельных растворах
3332 Диагностика вирусов гриппа А и В
Выводы
Введение:
Выделение и тонкая очистка вирусов имеет огромное значение при производстве вакцин и других медицинских препаратов на их основе. Диагностика вирусных заболеваний, основанная на высокочувствительном детектировании вируса, направлена на раннее его выявление и своевременное проведение противоэпидемических мероприятий, а также позволяет расширить возможности в лечении болезней, вызванных данным патогеном.
Применяемые на практике традиционные методы (в том числе, хроматографиче-ские) выделения и детектирования вирусов, как правило, демонстрируют низкую эффективность. Вероятно, причиной этому являются как физико-химические, так и биохимические особенности вирусных частиц, а именно, их низкая диффузионная подвижность, связанная с большим размером, а также сложная мультикомпонентная и достаточно лабильная структура вирионов. Разделение вирусов на классических хроматографических колонках, упакованных дисперсным сорбентом, где вся жидкость течет сквозь межчастичное пространство, осуществляется при абсолютном доминировании диффузионного массооб-мена между подвижной и неподвижной фазами. В случае таких разделительных сред вирусные частицы путем собственной диффузии должны проникнуть из межчастичного пространства внутрь поры, где отсутствует поток подвижной фазы, и подойти к поверхности, содержащей адсорбционно-активные сайты. Процесс десорбции сопровождается тем же движением частицы, но уже в обратном направлении, т. е. из порового пространства в межчастичный поток жидкой фазы. Такой ограниченный диффузией механизм разделения увеличивает продолжительность хроматографического процесса, а вместе с этим, и вероятность потери объектом биологической активности.
Огромные возможности для решения вопросов разделения вирусов предоставляет высокоэффективная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках, ВЭМДХ). Данный метод основан на использовании в качестве стационарных фаз макропористых полимерных сорбентов монолитного типа, в частности, твердых сополимеров на основе глицидилметакршшта (2,3-эпоксипропилметакрилата) и этженгликолъдиметак-рилата (ГМА-ЭДМА). Морфологические, стерические и гидродинамические свойства данных носителей позволяют проводить процессы эффективного разделения таких крупных объектов, как макромолекулы ДНК и белки. Осуществление скоростных разделений является следствием практически полного отсутствия диффузионных ограничений нормальному межфазовому переносу вещества. Это означает, что эффективное разделение макромолекул, имеющих невысокую диффузионную подвижность, на ультракоротких монолитных колонках (дисках) становится возможным благодаря присутствию полностью сквозного внутрипорового потока жидкости, что приводит к изменению обычного диффузнойного механизма межфазового массообмена вещества на конвекционный, определяемый высокой проницаемостью для потока жидкости монолитного сорбента. При этом именно вследствие резкого увеличения проницаемости сорбента существенно увеличивается диффузионная подвижность разделяемых молекул, что, соответственно, приводит к уменьшению времени, необходимого для достижения ими локализованного на поверхности проточных каналов (пор) адсорбционного центра и, соответственно, увеличению числа вероятных контактов с функциональной поверхностью. Кроме того, малый диаметр и открытая структура проточных пор, на поверхности которых происходит адсорбционное разделение, а также практическое отсутствие пристеночного слоя стагнантной (неподвижной) жидкости, обеспечивают минимальное диффузионное сопротивление подходу вещества к стенке поры. Таким образом, реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных дисперсных сорбентов, что позволит избежать деструкции биопродукта и, соответственно, потери его активности.
Адсорбционная хроматография с использованием в качестве стационарных фаз мо-, нолитных сорбентов в настоящее время детально исследована для разделения биологически активных веществ широкого ряда молекулярных размеров (пептиды, олигонуклеоти-ды, белки, ДНК, РЫК). Однако данные о применении монолитов для реализации межфа-, зовых процессов, построенных на динамической адсорбции крупных частиц, а именно, вирусов, практически отсутствуют.
В связи с высокой стоимостью вирусного материала и его патогенными свойствами на этапе разработки экспериментальных алгоритмов хроматографической сепарации вирусов представляется целесообразным использование модельных частиц, имитирующих геометрические параметры вирусов (размер и форму), и, следовательно, диффузионные характеристики, а также адсорбционные свойства их поверхности. Разнообразие структурных свойств поверхности вирусных частиц определяет механизм их адсорбционных взаимодействий с поверхностью сорбента, сопровождающихся образованием различного типа связей, а именно, высокоспецифических (или биоаффинных), и более слабых ионных, гидрофобных, координационных. Подобные взаимодействия можно воссоздать in vitro введением в искусственно конструируемые модельные наночастицы лигандов различной природы и специфичности.
Как правило, взаимодействие вирусов с клеткой основано на принципе комплементарное™ и происходит на границе раздела фаз, когда один из аффинных партнеров располагается в мембране клетки, а второй является компонентом поверхностной оболочки вирусной частицы, находящейся в потоке биологической жидкости. Скоростная аффинная хроматография на ультракоротких монолитных колонках предоставляет исключительные возможности для моделирования и изучения in vitro процессов специфического ком-плексообразования в динамических условиях. Помимо этого, именно аффинный вариант ВЭМДХ является единственным хроматографическим типом, позволяющим осуществлять выделение продуктов высокой степени чистоты из нативных биологических жидкостей с сохранением их активности, что чрезвычайно важно для вирусов.
Следует отметить, что принцип биологической комплементарности может использоваться в двух принципиальных вариантах межфазовых разделений, а именно, в динамическом (проточном) формате аффинной хроматографии, и в статическом (непроточном) формате биологических тест-систем. Монолитный материал и методологии, разработанные для скоростной аффинной хроматографии, могут быть использованы с целью создания биораспознающих систем в формате нанобиочипов, предназначенных для комплексного аналитического скрининга сложных биологических объектов, например, для диагностики вирусных заболеваний. В отличие от монолитных ГМА-ЭДМА сорбентов, использующихся в ВЭМДХ, эти носители, являясь непроточными системами, сохраняют ту же физическую и химическую организацию (структуру разделительного слоя).
Таким образом, развитие и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию вирусов, так и их достоверную идентификацию-с использованием современных полимерных материалов и новейших подходов диагностики вирусных инфекций с привлечением биочиповой технологии, является, несомненно, актуальной задачей.
Целью настоящей работы являлось исследование особенностей адсорбции крупных модельных частиц и вирусов на функционализированной поверхности ГМА-ЭДМА монолитных фаз в динамическом (проточном) формате, т. е. в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии на метакрилатных монолитах, а также в статическом (непроточном) варианте с использованием трехмерных биочипов с аналогичной полимерной поверхностью. В практические цели исследования также входила разработка схем выделения и методов детектирования вирусов, с учетом выявленных особенностей их адсорбции на поверхности монолитных фаз. В связи с вышесказанным, были поставлены и решались следующие задачи: конструирование физико-химических моделей вирусов с использованием различных материалов и методов; исследование особенностей адсорбционного поведения модельных наночастиц в динамических условиях различных вариантов ВЭМДХ;
• построение модельной системы, имитирующей взаимодействие вирус-клетка, при участии специально сконструированных наночастиц и функциопализированной поверхности монолитного сорбента; на примере модельных наночастиц, разработка методов биоанализа в формате биочипа, построенных на использовании монолитных полимерных слоев; разработка и оптимизация хроматографических схем выделения вируса гриппа из сложных биологических образцов, а также диагностической нанотест-системы для детектирования вируса гриппа непосредственно в клиническом материале.
Объектами исследования являлись физико-химические модели вирусов, полученные с использованием методов сшивки белка с помощью диальдегида и ковалснтной модификации поверхности полимерных наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки, а также вирусы гриппа.
В качестве методов исследования использовались: спектрофотометрия в УФ- и видимой областях, элементный анализ, ИК-спектроскопия, колориметрические, биохимические и биологические методы; экслюзионный, ионообменный и аффинный варианты жидкостной хроматографии; зональный и фронтальный хроматографические методы анализа; флюоресцентный и иммуноферментный методы анализа: метод твердофазной ден-ситометрии (в УФ и видимой области спектра); полиакриламидный гель-электрофорез.
Научная новизна работы состоит в следующем: на примере вирусоподобных синтетических частиц впервые научно обоснована возможность реализации скоростных эффективных процессов сепарации крупных биологических объектов (вирусов) с использованием ионообменного и биоаффинного вариантов жидкостной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках, отличающихся избирательностью адсорбции и энергией взаимодействия вещества с поверхностью стационарной фазы; впервые показана возможность проведения количественного анализа вирусоподобных частиц в формате ЗБ-биочипов на основе макропористого сополимера ГМА-ЭДМА с использованием детектирующего метода твердофазной денсито-метрии; путем выбора из широкого ряда кандидатов оптимального лиганда впервые предложен эффективный метод выделения вируса гриппа A (H1N1), основанный на псевдо-аффинном варианте хроматографии на монолитах.;
• впервые предложен высокочувствительный метод детектирования вирусов гриппа А и В с использованием разработанной тест-системы (биочипа).
Практическая значимость работы. Сконструированы биораспознающие системы для сепарации вирусов методом высокоэффективной псевдо-аффинной хроматографии на монолитах. Предложен метод чувствительной и эффективной диагностики вирусов гриппа А и В с использованием специально сконструированных ЗБ-биочипов (трехмерных биочипов). Таким образом, разработан и оптимизирован методологический комплекс, включающий сепарацию вирусов и их достоверную идентификацию с привлечением одного и того же ГМА-ЭДМА сорбента монолитного типа.
Основные положения, выносимые на защиту: физико-химические модели вирусов (вирусоподобные наночастицы) могут быть получены контролируемыми методами сшивки белка с использованием диальде-гида, а также ковалентной модификации полимерных наносфер белком и другими лигандами; адсорбция вирусоподобных наночастиц на функционализированной поверхности сорбента (монолита) определяется природой белка, локализованного на их поверхности; величина максимальной адсорбционной емкости сорбента в аффинном и ионообменном вариантах ВЭМДХ уменьшается с увеличением размера наночастиц и не зависит от скорости потока подвижной фазы; усложнение микроокружения на поверхности как сорбента, так и наночастиц в модельной системе, имитирующей взаимодействия «вирус-клетка», может ока-; зывать влияние на характеристики биоспецифического связывания; использование различных подходов к иммобилизации лигандов при создании эффективных псевдо-аффинных носителей демонстрирует возможность увеличения производительности хроматографических процессов, основанных на биоспецифическом взаимодействии вируса гриппа с адсорбционно-активными сайтами сорбента; методологические подходы детектирования и количественной оценки связывания, разработанные на примере вирусподобных частиц в формате непроточных ГМА-ЭДМА слоев (биочипов), могут быть положены в основу чувствительных тест-систем для диагностики вируса гриппа.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих международных симпозиумах и конференциях: 5th International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), 2-ая Санкт-Петербургская конференция молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах»
Санкт-Петербург, Россия, 2006), 2nd Monolith Summer School «Application in biochroma-tography, bioconversion and solid phase synthesis» (Порторож, Словения, 2006), 4th International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006), The Young Scientists' and Students' International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, включающих 3 полнотекстовые статьи, а также 7 тезисов устных и стендовых докладов.
Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 169 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 44 рисунками, список цитируемой литературы включает 209 источников.
