Главная » 2014»Июль»27 » Скачать Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе. Минибаева, Фарида Вилевна бесплатно
03:13
Скачать Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе. Минибаева, Фарида Вилевна бесплатно
Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе
Диссертация
Автор: Минибаева, Фарида Вилевна
Название: Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе
Справка: Минибаева, Фарида Вилевна. Активные формы кислорода и ионная проницаемость плазмалеммы в растительных клетках при стрессе : диссертация доктора биологических наук : 03.00.12 Казань, 2005 360 c. : 71 05-3/196
Объем: 360 стр.
Информация: Казань, 2005
Содержание:
1 ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ ВВЕДЕНИЕ
Глава
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Кислород двуликий Янус
12 Активные формы кислорода: образование и биохимические свойства
13 Токсическое действие АФК: Окислительное повреждение макромолекул
14 Перекисное окисление липидов
15 Окислительное повреждение нуклеиновых кислот
16 Окислительное повреждение белков
17 Регуляторные эффекты АФК Окислительный взрыв в растительных клетках
18 Источники АФК в растительных клетках
19 Редокс системы плазмалеммы
110 Цитохромы 6-типа в плазматической мембране
111 НАДФ-Н -утилизирующие флавоферменты плазматической мембраны растений
112 Пероксидаза как стрессовый фермент
113 Продукция АФК экстраклеточными пероксидазами
114 Физиологические функции экстраклеточных пероксидаз при окислительном стрессе
115 Каталаза-подобная активность пероксидаз
116 Патоген-индуцированный стресс в клетках растений
117 Обезвоживание клеток высших и низших растений Раневой стресс в клетках растений Роль АФК в системе сигнальной трансдукции: связь с ионной проницаемостью плазмалеммы и энергетическим обменом растительных клеток
118 АФК и проницаемость мембран для Са, К", Н Термогенез, Энергетические потери клетки как составляющая часть энергетического баланса ИЗ
Глава
II ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ т
21 Объекты исследования Методы исследования
Глава
III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 Патоген-индуцированный окислительный взрыв в растительных клетках
32 Трех-компонентная система патоген-индуцированного окислительного взрыва в суспензионной культуре клеток фасоли
33 >t Сигнальные события при патоген-индуцированном окислительном взрыве в клетках фасоли
34 Окислительный взрыв в клетках хлореллы при инфицировании микоплазмой Acholeplasma laidlawii
35 Эффекты обезвоживания на продукцию АФК в клетках лишайников и бриофитов
36 Окислительный взрыв в клетках лишайников подотряда Peltigerineae, индуцированный обезвоживанием
37 Окислительный взрыв в клетках печеночника Dumortiera hirsuta, индуцированный обезвоживанием и регидратацией
38 Стехиометрия продукции АФК в тканях D hirsuta Продукция АФК в растительных клетках и тканях при раневом стрессе
39 Роль супероксидного радикала в стрессовых ответах корней пшеницы при раневом стрессе
310 Регуляция продукции и содержания Ог" в корневых клетках при поранении I»
311 Возможные источники генерации супероксидного анион-радикала поверхностной мембраной растительных клеток
312 Вклад редокс-системы плазмалеммы в продукцию Oi клетками корней пшеницы
313 Участие пероксидаз клеточной поверхности в продукции 02*" клетками корней пшеницы Эксперименты in situ
314 Влияние салициловой и ряда других органических кислот на редокс-активность корней пшеницы I»
315 Выделение и очистка экстраклеточных пероксидаз клеток корней пшеницы
316 Происхождение и механизмы появления экстраклеточных пероксидаз при раневом стрессе
317 Ионная проницаемость плазмалеммы и АФК Участие супероксидного анион-радикала в детоксикации ксенобиотиков растительными клетками
318 Вклад продукции АФК в тепловыделение растительными клетками
Глава
IV ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение:
Растения животные постоянно испытывают на себе влияние экстремальных воздействий окружающей среды и различных антропогенных факторов. Способность к защите от действия неблагоприятных факторов среды (стрессоров) столь же обязательное свойство любого организма, как питание, движение, размножение и другие. По словам Д.Н. Насонова, «центральным вопросом эволюции является адаптация, приспособление живого к среде» (цит. По Браун, Мозженок, 1987). В устойчивости растений к действию каждого из факторов внешней среды помимо специфических, зависящих от особенностей воздействия и вида растения, важную роль играют неспецифические реакции клетки, возникающие при действии любых неблагоприятных факторов. Стресс, как известно, «это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих под влиянием любых сильных воздействий и сопровождающихся перестройкой защитных систем организма» (Селье, 1972; Полевой, 1989). Hans Selye выделял три стадии генерализованного адаптационного синдрома: «реакцию тревоги», стадию резистентности первоначальную, и стадию истощения. «Реакция тревоги обозначает собой неспецифическую реакцию, представляющую соматическое выражение общего «призыва к оружию» защитных сил организма» (Селье, 1972). Необходимо отметить, что еще в 1901 г. Н.Е. Введенским была выдвинута гипотеза о всеобщей ответной реакции лшвых систем на клеточном уровне в ответ на раздражение (Введенский, 1901, цит. по Муртази, 1963). Видным физиологом животных и растений, многие годы работавшим в Казанском институте биологии, Фаридом Фатыховичем Муртази была доказана общность харатера неспецифических ответных реакций в клетках животных и растений (Муртази, 1963). Суть неспецифических реакций в значительной степени сводится к тем изменениям, которые обнаруживаются в мембранных образованиях клетки. Более того, найдена связь между устойчивостью растений к различным воздействиям и состоянием их мембранных компонентов (Чиркова, 2002).Значительную роль в ответных реакциях на воздействия играют окислительные процессы, протекающие в живых организмах, в частности, свободнорадикальные реакции, связанные с участием кислородных радикалов. Кислород играет ключевую роль в энергетике большинства живых существ. Он служит окислителем питательных веществ при дыхании животных, растений, грибов и бактерий. Без кислорода обходятся лишь сравнительно немногочисленные виды, обитающие в бескислородных (анаэробных) условиях и покрывающие свои энергетические потребности за счет брожения. Однако высокая окислительная способность кислорода, необходимая для его функционирования в дыхательной системе, из добра превращается в зло, если принять во внимание возможность «паразитных» химических реакций окисления кислородом различных химических веществ в живой клетке (Скулачев, 1996). Эти самопроизвольные, неферментативные реакции всегда начинаются с одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, давая его анион-радикал, или супероксид (Ог*"). Предположение активирующие о том, что кислород, в живых еще клетках в 19 существуют в. механизмы, химик возникло Швейцарский Х.Ф. Шейнбайн, открывший озон, в 1845 г. выступил с теорией окислительных процессов, согласно которой в живых клетках имеются соединения, способные легко окисляться в присутствии О2 и таким образом активировать кислород. Именно эти процессы обуславливают быстрое потемнение поверхности растительных тканей, таких как ткани яблок, картофеля, плодовых тел грибов (цит. по Полевой, 1989). Таким образом, кислород необходим для живой клетки как окислитель питательных веществ, однако опасен как окислитель ДНК и других жизненно важных компонентов. Клетка располагает многоуровневой системой защиты от повреждающего действия кислорода (Мерзляк, 1989, Веселов и др., 2002). Эта система состоит из механизмов: (1) предотвращающих «паразитные» химические реакции одноэлектронного восстановления кислорода и (2) убирающих продукты такого восстановления. Клетки, не справившиеся с задачей защиты от кислородной 8 опасности и, тем самым, поставившие под удар свой генетический аппарат, кончают самоубийством, включая апоптоз, вовлекающий активные формы кислорода (АФК). С практической точки зрения, изучение роли активированного кислорода в клетках и тканях животных и человека оказалось исключительно плодотворным. В фокус этого направления попали такие фундаментальные медико-биологические проблемы как повреждение и устойчивость клетки, фагоцитоз, бактерицидные эффекты и др. Выяснилось, что активированный кислород выступает в роли важного патогенетического фактора при многих тяжелых заболеваниях: ишемической болезни сердца, лучевом поражении, катаракте, воспалительных процессах, авитаминозе, раке и т.д. Все это, естественно, привело к резкому нарастанию интереса к различным аспектам кислородной проблемы. Таким образом, в потоке научной литературы, посвященной активированному кислороду, существует множество работ, выполненных на объектах животного происхождения. Еще до недавнего времени изучению этих процессов в растительных объектах уделялось недостаточно внимания, хотя роль активированного кислорода в мембранах растений огромна при самых разнообразных воздействиях (Мерзляк, 1989). Именно эти организмы способны к выделению кислорода, наиболее богаты пигментами-сенсибилизаторами, отличаются высокой реакционной способностью молекулярных компонентов и обладают развитой защитной системой. В настоящее время становится все более очевидным, что при действии на растения множества стрессовых факторов одна из самых ранних стрессовых реакций это образование ряда активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала и т.д.), которые могут выполнять роль сигнальных молекул, а также другие функции в ходе адаптации клеток.Постановка проблемы, ее актуальность Чрезвычайно широкий спектр биохимических эффектов АФК, в частности супер оксидного радикала, объединяет все возрастающий интерес к влиянию их на функциональную активность клеток. Долгое время доминирующими в этой области были представления, что АФК действуют лишь как разрушители и не обладают никакими регуляторными свойствами (Пескин, 1997). Перекисное окисление липидов, окислительные модификации белков, нуклеиновых кислот типичные следствия токсичного действия кислородных радикалов. Возникает вопрос: «Неужели на всем протяжении эволюции в живых системах не было создано достаточно плодотворного механизма, полностью предотвращающего образование АФК, которые обладают необычайно высокой «агрессивностью» и способны повреждать практически все компоненты клетки, включая белки, ферменты, ДНК и мембранные структуры»? Возможно, разгадка кроется в другом. В настоящее время получены сведения о том, что АФК выполняют регуляторные функции в организме и в некоторых случаях выступают в качестве сигнальных молекул (Мерзляк, 1999). Вероятно, физиологические концентрации АФК не только не токсичны, но и необходимы для поддержания функций клеток. В последние годы были выявлены регуляторные функции АФК, а именно участие в гормональном сигналлинге, росте, клеточном и тканевом развитии. Они могут контролировать такие важнейшие биологические процессы, как клеточное деление митоз и программируемую роль клеточную смерть апоптоз, играющие развития существенную в реализации программы индивидуального многоклеточных организмов (Шорнинг и др., 2000). Важная роль отводится АФК в стрессовых ответах растительных клеток. В целом, в нормально функционирующем организме существует баланс между активацией и дезактивацией кислорода, поэтому содержание его активных форм поддерживается на безопасном уровне (Аверьянов, 1991). Баланс, однако, может сдвигаться в окислительную сторону при самых разнообразных патологических и 10 стрессовых состояниях как животных, так и растительных клеток. Было показано, что при фагоцитозе чужеродных веществ резко увеличивается поглощение кислорода. Это явление, открытое еще в 30-е годы XX в., получило название «дыхательного (окислительного) взрыва» (Segal, Abo, 1993). Примечательно, что одним из первооткрывателей этого явления был ученый-медик Казанского университета Андрей Дмитриевич Адо (Ado, 1933, цит. по Владимирову, Шерстневу, 1989). Позднее оказалось, что образование супероксида (и других АФК) присуще не только фагоцитирующим клеткам, но происходит и в других типах клеток. Особое внимание в настоящее время уделяется быстрой продукции АФК с последующим каскадом ответов (реакции окислительного взрыва) растительных клеток при воздействии биотических и абиотических стрессоров. Считается, что продукция 02* и пероксида водорода (Н2О2) является одной из ранних реакций, происходящих при патогенной атаке в растительных клетках (Bolwell et al., 1995; Alvarez et al., 1998). Показано, что окислительный взрыв может происходить в растительных клетках также при действии самых разнообразных абиотических стрессоров. Так, например, в развивающихся проростках кукурузы он индуцируется при действии низкой температуры (Prasad, 1996), в растениях гороха под влиянием засухи (Могап et al., 1994), в суспензионной культуре табака при гипоосмотическом и механическом воздействии (Cazale et al., 1998). Причем, как свидетельствуют экспериментальные данные, основными источниками Ог и Н2О2 в ходе окислительного взрыва являются ферментативные системы, локализованные на внешней поверхности растительных клеток (Wojtaszek, 1997; Minibayeva et al., 2001). В связи с этим, редокс-ферменты, локализованные на клеточной поверхности, в частности редокс-системы плазматической мембраны и пероксидазы клеточной поверхности, представляют особый интерес. Известно, что увеличение пероксидазной активности является неспецифическим ответом на биотические и абиотические стрессоры (Bolwell, Wojtaszek, 1997; Bernards et al., 1999; Sreenivasulu et al., 1999; Fang, Kao, 2000; Velikova et al., 2000). 11 Предполагается, что пероксидаза может выступать в качестве регулятора формирования адаптационных процессов при различных физиологических нагрузках на клетки. Таким образом, несмотря на широко известные токсические эффекты активированного кислорода, в настоящее время сформировалось представление об АФК как ключевых регуляторах метаболических и защитных реакций живых клеток. Выявление возможных источников продукции АФК, а также путей их детоксикации является важным подходом к изучению их роли при самых разнообразных стрессовых воздействиях. Исследование особенностей генерации АФК, а также выяснение роли АФК в каскаде сигнальных событий может внести существенный вклад в расшифровку механизмов адаптационных процессов растительных клеток. Цель и задачи; Основной целью исследований было изучение особенностей образования АФК растительными клетками, выявление источников их продукции на клеточной поверхности и участия АФК в в ранних ответных реакциях, в частности в сдвигах ионной проницаемости плазмалеммы, в ответ на биотические и абиотические стрессовые воздействия. Были поставлены следующие задачи; 1. Исследовать образование Н2О2 суспензионными клетками французской фасоли Phaseolus vulgaris L. при обработке элиситором, выделенным из патогенного гриба Colletotrichum lindemuthianum, изучить взаимосвязь продукции Н2О2 с другими сигнальными процессами. 12 Исследовать образование Ог одноклеточной водорослью хлорелла Chlorella vulgaris при инфицировании микоплазмой Acholeplasma laidlawii. 3. Изучить влияние обезвоживания последующей регидратации на образование Ог и Н2О2 клетками лишайников и печеночника, а таюке выявить зависимость продукции АФК от метаболической активности клеток. 4. Исследовать образование Ог" и активность экстраклеточной пероксидазы в клетках корней пшеницы при раневом стрессе, 5. Выявить возможное участие редокс-системы плазмалеммы и пероксидаз клеточной поверхности в продукции супероксида клетками отсеченных корней пшеницы. 6. Выделить, очистить и охарактеризовать экстраклеточные изоформы пероксидаз клеток корней пшеницы. Выявить возмолсные механизмы появления новых индуцированных поранением экстраклеточных пероксидаз. 7. Исследовать экстраклеточные Ог" синтазную и пероксидазную активности при модификации ионной проницаемости плазмалеммы клеток корней пшеницы детергентами, трипсином, ионами металлов, ионами кальция, холестерина, ионофорами, салицилатом, рядом ди-, трикарбоновых кислот. 8. 9. Изучить образование Ог* и экстраклеточной пероксидазной активности при действии на корни пшеницы ксенобиотика амидопирина. Выявить возмоишую взаимосвязь между образованием супероксидного радикала и тепловыделением в клетках корней пшеницы и одноклеточной водоросли хлорелла Chlorella vulgaris. 13 Положения, выносимые на защиту; 1. Для производства патоген-индуцированного окислительного взрыва в суспензионной культуре клеток фасоли, необходимо наличие трехкомпонентной системы, включающей в себя пероксидазу клеточной стенки, подщелачивание апопласта, восстановитель. 2. В клетках лишайников и бриофитов окислительный происходит взрыв при обезвоживании и последующей регидратации у видов, характеризующихся высокой метаболической активностью. 3. В продукции О2" в ходе раневого стресса в клетках корней пшеницы участвуют редокс система плазмалеммы и пероксидазы клеточной поверхности. Появление новых АФК продуцирующих пероксидаз в апопласте связано с высвобождением этих молекул из плазмалеммы и клеточной стенки, а не секрецией из цитозоля. 4. Проницаемость плазмалеммы для протонов и изменение их содержания в апопласте регулируют вовлечение различных ферментных систем в продукцию АФК. Увеличение содержания V* в апопласте растительных клеток свидетельствует об активации редокс-систем плазмалеммы, а уменьшение содержания Н приводящее к подщелачиванию апопласта, активирует экстраклеточные пероксидазы для продукции АФК. 5. Одной из физиологических функций АФК, производимых редокс системами плазмалеммы и пероксидазами, локализованными на поверхности клеток корня, является детоксикация ксенобиотиков. 14
