Главная » 2014»Август»16 » Скачать Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров. Фахруллин, Равиль Фаридович бесплатно
20:46
Скачать Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров. Фахруллин, Равиль Фаридович бесплатно
Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров
Диссертация
Автор: Фахруллин, Равиль Фаридович
Название: Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров
Справка: Фахруллин, Равиль Фаридович. Получение, свойства и применение ДНК-содержащей нанопленки для пьезокварцевых биосенсоров : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 Казань, 2006 170 c. : 61 06-3/1178
Объем: 170 стр.
Информация: Казань, 2006
Содержание:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Антитела к нативной ДНК как критерий диагностики аутоиммунных заболеваний
12 Наногравиметрические биосенсоры как инструмент биохимических исследований
121 Биосенсоры на основе пьезокварцевых резонаторов
122 Физические основы масс-чувствительности пьезокварцевых резонаторов
123 Конструирование пьезокварцевого биосенсора
124 Иммобилизация биологического компонента биосенсора
13 Методы формирования и изучения свойств ДНК-содержащих рецепторных покрытий биосенсоров
131 Ковалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот
132 Нековалентные методы иммобилизации нуклеиновых кислот
133 Бионанотехнологические подходы к иммобилизации нуклеиновых кислот
134 Атомно-силовая микроскопия как инструмент для изучения биологических объектов
Введение:
Актуальность проблемы
Развитие биохимии в XXI веке определяется постоянным совершенствованием методов исследования. Последнее десятилетие происходит стремительное внедрение в биологическую науку новых подходов к изучению взаимодействия биологических макромолекул. В результате разработаны и постепенно входят в практику эффективные методы лабораторной диагностики различных заболеваний (Jain, 2005а).
Объектом пристального внимания исследователей являются антитела (AT) к ДНК, высокое содержание которых отмечается при системной красной волчанке (СКВ) и некоторых других аутоиммунных заболеванях (Blatt, Glick, 1999; Pincus et al., 2002, Pisetsky, 2004), в связи с чем постоянно ведется поиск новых методов анализа (Hahn, 1998).
Одним из подходов к детекции и изучению AT к нативной ДНК является разработка пьезокварцевых биосенсоров, отличающихся высокой чувствительностью и экспрессностью (Luppa et al., 2001; Kankare et al., 2006). Принцип действия пьезокварцевых биосенсоров основан на массV чувствительности пьезокварцевого резонатора, позволяющей фиксировать изменения массы на поверхности электродов в субнанограммовом диапазоне (Lu et al, 2004). Применение таких биосенсоров в проточно-инжекционном режиме дает возможность изучить процесс взаимодействия макромолекул in situ (Marxer et al., 2003). Из альтернативных средств исследования в аналитической химии и материаловедении пьезокварцевые сенсоры превращаются в один из мощных инструментов молекулярной биологии, генетики, нейробиологии, микробиологии, иммунологии и биохимии (Shons et al., 1972; Ко, Park, 2005; Yang et al., 2006).
На сегодняшний день описаны пьезокварцевые биосенсоры для ДНК-диагностики (Zhou et al., 2001) и определения некоторых ДНК-связывающих белков (Kim et al., 2002). Для формирования ДНК-содержащего рецепторного слоя подобных биосенсоров используется ковалентная иммобилизация однонитевых олигонуклеотидов (Mirsky, 2002).
Практически любой из биологически значимых полимеров - ДНК, белки, углеводы, может быть отнесен к нанообъектам, то есть таким объектам, хотя бы одно из линейных измерений которых не превышает 100 нм (Seeman, 2001; Котельников, 2004). Относительно недавно было установлено, что нанообъекты характеризуются особыми свойствами, позволяющими использовать их во многих научных и практических приложениях (Kawasaki, Player, 2005). Нанотехнология - область знания о структуре и свойствах нанообъектов, буквально ворвалась в биологию, предоставив последней целый арсенал высокоточных методов (Roco, 2003). Не исключено, что использование в качестве «строительных блоков» нанотехнологии таких биологических полимеров как ДНК (Park et al., 2005) в недалеком будущем позволит разработать наноустройтва и наномашины, которые коренным образом преобразуют современную науку и технику (Drexler, 1981).
Если еще недавно основное внимание уделялось традиционным методам, заключающимся в переходе от макрообъектов к микрообъектам, то сегодня разрабатывается также обратный подход - от малого к большему, или, как выразился один из основателей нанотехнологии Ричард Фейнман (Feynman, 1960; Silva, 2004): «снизу вверх». В связи с этим, в последние годы для формирования тонких пленок биологических веществ используются процессы самосборки молекулярных ансамблей (Winfree et al., 1998; Whitesides, Grzybowski, 2002). Формирование и структуру ДНК-содержащей нанопленки можно изучать методами наногравиметрического анализа и атомно-силовой микроскопии. Применение нанопленок в качестве биоселективных элементов сенсоров позволяет сохранить антигенные свойства нативной ДНК. Изучение процессов создания нанопленок представляет самостоятельный интерес для исследования многих аспектов взаимодействия биологических макромолекул. В связи с этим представляется весьма актуальным разработка и определение свойств ДНК-содержащей нанопленки для использования в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было получение и характеристика свойств ДНК-содержащей нанопленки для создания рецепторного слоя пьезокварцевого биосенсора.
В работе были поставлены следующие задачи: о исследовать сорбцию потенциальных слоев-предшественников (поли-Ь-лизин, фибронектин, спермин, спермидин и нафион) на поверхности серебряных и золотых электродов пьезокварцевых резонаторов и их способность к связыванию нативной ДНК; о определить оптимальные условия формирования поли-Ь-лизинового слоя-предшественника и ДНК-содержащей пленки; о охарактеризовать кинетику формирования, стабильность, вязкостно-эластичные свойства и структуру поверхности ДНК-содержащей нанопленки; о изучить возможность применения пьезокварцевого биосенсора на основе полученной ДНК-содержащей нанопленки для определения AT к нативной ДНК в сыворотке крови.
Научная новизна
Установлено, что поли-Ь-лизин может быть иммобилизован на поверхности серебряных и золотых электродов кварцевых резонаторов в процессе самосборки, без предварительной модификации металлической поверхности.
Впервые для изучения межмолекулярного взаимодействия ДНК и поли-L-лизина использован метод проточно-инжекционного наногравиметрического анализа с одновременным измерением частоты колебаний и реактивного сопротивления кварцевого резонатора. Показано, что характер связывания ДНК и иммобилизованного поли-Ь-лизина зависит от вторичной структуры полинуклеотида. Описана кинетика связывания ДНК с иммобилизованным поли-Ь-лизином, определены эластичные свойства ДНК-содержащей нанопленки. Методом атомно-силовой микроскопии получены изображения ДНК-содержащей нанопленки и изучена структура ее поверхности.
Установлено, что полученная ДНК-содержащая нанопленка может быть использована в качестве распознающего элемента биосенсоров для определения AT к нативной ДНК.
Практическая значимость
Разработанный способ поэтапной иммобилизации поли-Ь-лизина и нативной ДНК на серебряных и золотых электродах кварцевых резонаторов может быть использован при конструировании других типов биосенсоров или ДНК-содержащих покрытий.
Представленный в работе протокол применения пьезокварцевого. биосенсора на основе ДНК-содержащей нанопленки может быть использован для экспресс-анализа AT к нативной ДНК.
Положения, выносимые на защиту:
1. Способ формирования на металлических поверхностях наноструктурированной эластичной ДНК-содержащей нанопленки.
2. Использование полученной ДНК-содержащей нанопленки в качестве чувствительного элемента пьезокварцевых биосенсоров для определения AT к нативной ДНК в биологических жидкостях.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2004-2006 гг.), на Международной научной конференции «Новая Геометрия Природы» (Казань, 2003), Всероссийской конференции "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека" (Петрозаводск, 2003), Всероссийской конференции по аналитической химии "Аналитика России -2004" (Москва, 2004), научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), VI - VIII Международных научных молодежных школах "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2002-2004), VI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2006), 10-ой Школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006), XIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик, Республика Марий Эл, 2006).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включает 52 рисунка и 6 таблиц. Список использованных библиографических источников включает 262 источника, из них 245 - иностранные работы.
