Главная » 2014»Август»23 » Скачать Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров. Скотти, Ольга Сергеевна бесплатно
07:18
Скачать Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров. Скотти, Ольга Сергеевна бесплатно
Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров
Диссертация
Автор: Скотти, Ольга Сергеевна
Название: Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров
Справка: Скотти, Ольга Сергеевна. Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.15 / Скотти Ольга Сергеевна; [Место защиты: Всерос. науч.-исслед. ин-т генетики и разведения с.-х. животных] Санкт-Петербург-Пушкин, 2008 125 c. : 61 08-3/159
Объем: 125 стр.
Информация: Санкт-Петербург-Пушкин, 2008
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Роль пролактина в репродукции млекопитающих
111 Структура молекулы пролактина (общие сведения)
112 Биологические функции пролактина
113 Гормональная регуляция фолликулогенеза и мейоза ооцитов коров
114 Участие пролактина в апоптозе и пролиферации клеток в процессе фолликулогенеза
12 Внутриклеточные механизмы реализации эффектов гипофизарных гормонов на созревание яйцеклетки
121 Характеристика рецепторов к гипофизарным гормонам на овариальных клетках
122 Современные представления о механизмах реализации эффектов пролактина на фолликулярные клетки
2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
21 Материал исследований
22 Методы исследований
221 Выделение и морфологическая оценка ооцит-кумулюсных комплексов
222 Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов
223 Культивирование клеток гранулезы
224 Цитогенетический анализ
225 Определение уровня пикнозов в кумулюсных клетках
226 Анализ активности киназы гистонов HI
227 Определение активности MAP киназ
228 Получение клеток эпителия яйцевода
229 Оплодотворение ооцитов
2210 Статистическая обработка полученных данных
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
31 Исследование влияния пролактина на созревание ооцитов, выделенных из фолликулов разного диаметра
32 Деструктивные процессы в кумулюсе ооцит-кумулюсных комплексов при культивировании в средах с пролактином
33 Культивирование доимплантационных эмбрионов в средах с пролактином
34 Влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах коров
35 Активация киназы гистонов HI в процессе созревания ооцитов коров in vitro в средах с добавлением пролактина
36 Влияние пролактина на активацию MAP киназ в динамике мейоза ооцитов коров in vitro
37 Роль цАМФ-зависимых внутри клеточных механизмов, опосредующих действия пролактина
371 Влияние теофиллина и пролактина на созревание ооцитов коров in vitro
372 Эффект дбцАМФ на созревание ооцитов коров in vitro
373 Оплодотворяемость ооцитов и развитие эмбрионов в культуральных средах с добавлением дбцАМФ
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Введение:
Актуальность темы
Современные методы репродуктивных технологий, в основе которых лежит базовый способ дозревания ооцитов in vitro, такие, как трансплантация эмбрионов, клонирование, трансгенез, получение эмбриональных стволовых клеток были разработаны' и интенсифицируются благодаря научным разработкам в области исследования механизмов регуляции, фолликуло- и оогенеза. Несмотря на то, что достижения эмбриотехнологий в последние годы убедительно доказывают возможность использования особей, полученных путем клонирования или- трансгенеза в животноводстве, фармакологии и в медицине, эффективность этих технологий низкая. По прежнему актуальным остается вопрос о приобретении яйцеклеткой, созревшей in vitro, компетентности к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов. Процесс завершения мейоза вне организма зависит от многих факторов, среди которых немаловажную роль играют система культивирования'. За1 последние 30 лет исследователями проделана' большая работа по оптимизации моделей дозревания ооцитов. В работах использовались модели интрафолликулярного культивирования [20], культивирование на стенках фолликулов [21], среды, кондиционированные клетками гранулезы [127, 128] и т.д. Использование клеточных элементов фолликулов обеспечивало повышение уровня созревших клеток и выхода эмбрионов. Введение в среды для культивирования различных гормонов и биологически активных веществ позволяет выявлять характер их воздействия на состояние хроматина соматических клеток фолликула и гамет, оценивать проспективность их потенции к оплодотворению и дальнейшему формированию эмбрионов. В настоящее время ведущая роль гипофизарных гормонов: фолликулостимулирующего и лютеинизирующего в регуляции фолликуло- и оогенеза твердо установлена. В то же время, возможная роль пролактина, еще одного гипофизарного гормона в механизмах формирования биологически полноценной яйцеклетки недостаточно ясна. Рядом авторов установлено, что пролактин оказывает стимулирующий эффект на созревание ооцитов [132, 52, 205]. Обнаружено, что качество ооцитов, полученных от суперовулированных телок коррелирует с увеличенным содержанием в фолликулах пролактина [205]. Установлено, что пролактин, добавленный в культуральную среду в процессе созревания ооцитов благоприятно влияет в дальнейшем при оплодотворении in vitro на выход полноценных эмбрионов на стадии бластоцисты [13, 196]. Показано, что гомозиготные самки мышей с инактивированным геном для лактогенного рецептора бесплодны, вследствие многочисленных репродуктивных аномалий, включая овуляцию, увеличение количества не возобновивших мейоз ооцитов, понижение оплодотворяемости яйцеклеток и их способности, к дальнейшему развитию [42]. Полученные недавно данные об экспрессии мРНК рецепторов пролактина в ооцитах и ранних эмбрионах мышей, а также в овариальных клетках овец указывают на возможность прямого воздействия пролактина на формирование зрелой яйцеклетки [165, 118].
В этой связи, вопрос о механизмах действия пролактина на мейоз и возможных путей реализации становится актуальной проблемой генетических основ репродуктивной биологии. *
Цель настоящей работы
Исследовать механизмы реализации эффектов пролактина на мейоз ооцитов при их созревании in vitro и вовлечение в эти процессы соматических клеток фолликулов.
В работе решались следующие конкретные задачи:
1.Сравнить степень чувствительности овариальных клеток из фолликулов-разного диаметра к воздействию пролактина, с учетом: - стадии мейоза ооцитов; -степени экспансии клеток кумулюса; -уровня пикнозов в кумулюсе; -оплодотворяемости ооцитов;
•развития доимплантационных эмбрионов;
2.Охарактеризовать влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах коров из фолликулов разного диаметра;
3. Изучить действия пролактина на активацию киназы гистонов HI и MAP киназ ERK1 и ERK2 в процессе созревания ооцитов коров in vitro;
4. Выявить эффекты дбцАМФ на завершение мейоза в ооцитах, созревших в присутствии пролактина, их оплодотворение и развитие эмбрионов;
5. Проанализировать роль цАМФ/протеинкиназа А-зависимого сигнального пути в реализации действия ПРЛ на созревание окруженных кумулюсом ооцитов коров.
Научная новизна
Впервые с использованием модели вне фолликулярного дозревания ооцитов, выделенных из фолликулов различного диаметра, проведен комплексный анализ эффектов бычьего пролактина на ' мейотические преобразования хромосом, статус хроматина кумулюса, развитие преимплантационных эмбрионов коров.
Проанализирована кинетика мейоза в ооцитах овариальных фолликулов коров разного диаметра, прокультивированных в присутствии пролактина.
Показано вовлечение в процессы реализации эффектов пролактина на мейоз ооцитов in vitro киназы гистонов HI и MAP киназ.
Идентифицирован характер действия дбцАМФ* на завершение мейоза ооцитах, созревших в присутствии пролактина, дальнейшее их оплодотворение и развитие эмбрионов. Получены данные, свидетельствующие о возможном участии цАМФ* зависимого внутриклеточного пути в опосредовании действия пролактина на ооцит-кумулюсные комплексы коров.
Теоретическая и практическая значимость работы Теоретически обоснована модель опосредованного клетками кумулюса характера действия пролактина на созревание коровьих яйцеклеток. Выявлено, что характер влияния пролактина на созревание ооцитов коров, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбрионов зависит от диаметра исходного фолликула, то есть от степени дифференцировки фолликулярных клеток. Наблюдаемое пролонгируещее действие ПРЛ на процесс мейоза ооцитов, вероятно, способствует синхронизации ядерного цитоплазматического созревания. Полученные результаты дополняют имеющиеся представления о внутриклеточных сигнальных путях реализации эффектов пролактина in vitro на мейоз в ооцитах коров. Наши экспериментальные данные доказывают, что действие гормона может осуществляться через разные сигнальные пути, в том числе и через цАМФ-зависимый путь, по крайней мере частично, как на уровне синтеза и распада цАМФ, так и через регуляцию активностей MAP киназы и киназы гистонов HI. Анализ данных исследований по выявлению эффектов пролактина и теофиллина на ооцит и его кумулюс свидетельствуют о сопряжении сигнального каскада, индуцированного ПРЛ в ооцит-кумулюсных. комплексах коров, и цАМФ-зависимого внутриклеточного пути.
Результаты экспериментов позволяют предположить, что запуск определенного сигнального каскада пролактином в ооцит-кумулюсном комплексе зависит от стадии фолликулярного созревания, соответственно, степени зрелости яйцеклетки.
Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм, на основе использования 50 нг/мл прола, позволяющая повышать выход биологически полноценной яйцеклетки и эмбрионов коров. Апробация работы
Материалы диссертации были доложены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакдемии, представлены на Международных конференциях. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино (2005, 2007 годы), «Клеточное ядро». Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе в журнале «Цитология». Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 215 источников, в том числе 194 на иностранном языке. Диссертация изложена на 125 страницах, включает 7 таблиц, 21 рисунок.
