Главная » 2014»Август»21 » Скачать Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo. Мальцева, Валентина бесплатно
04:26
Скачать Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo. Мальцева, Валентина бесплатно
Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo
Диссертация
Автор: Мальцева, Валентина Николаевна
Название: Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo
Справка: Мальцева, Валентина Николаевна. Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.02 / Мальцева Валентина Николаевна; [Место защиты: Ин-т биофизики клетки РАН] Пущино, 2007 138 c. : 61 07-3/1564
Объем: 138 стр.
Информация: Пущино, 2007
Содержание:
1 Введение
Глава
I Обзор литературы Иммунная система и опухоль
11 Общая характеристика опухолевых клеток, их особенности
12 Классификация опухолей
13 Компетентность иммунной системы в отношении опухолей
14 Способы избегания клетками опухоли надзора иммунной системы
15 Влияние опухоли на компоненты иммунной системы
16 Теории взаимодействия опухоли и иммунной системы Роль стромы опухоли
17 Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы)
18 Общая характеристика
19 Мембранные рецепторы нейтрофилов
110 Респираторный взрыв и его регуляция
111 Структура NADPH оксидазы
112 Активация NADPH оксидазы, сигнализация
113 Двойственное поведение активных форм кислорода (АФК)
114 Характеристика А ФК
115 Системы генерации и инактивации активных форм кислорода
116 А ФК польза или вред?
117 Участие АФК в процессах канцерогенеза
118 Влияние активных форм кислорода на сигнальные системы
119 Неоднозначность роли нейтрофила в канцерогенезе
120 Антиопухолевая активность
121 Проопухолевая активность
Глава
II Материалы и методы исследования
21 Материалы Ъ1 Ъ
22 Биологический объект
23 Изоляция перитонеалъных нейтрофилов мыши
24 Подготовка проб крови
25 Модель экспериментальной опухоли
26 Линии клеток
27 Формирование солидной формы опухоли
28 Регистрация хемилюминесценции
29 Хемилюминометр, программы и режим измерения
210 Измерение хемилюминесценции цельной крови
211 Измерение хемилюминесценции изолированных клеток
212 Микроскопия клеток
213 Гистологический анализ тканей
214 Анализ спектра белков методом электрофореза
215 Обработка результатов
Глава
III Результаты
31 Модель экспериментальной опухоли на мышах
32 Оценка статуса лейкоцитов периферической крови
33 Популяционный состав клеток крови
34 Продукция А ФК клетками крови
35 Анализ клеток, изолированных из очага острого воспаления
36 Морфологические изменения нейтрофилов
37 Функциональные изменения нейтрофилов
38 Оценка адгезивных свойств
39 Продукция А ФК периферическими нейтрофилами мыши
310 Спонтанная продукция А ФК
311 Активированная ФМЛФ продукция А ФК
312 Оценка вклада отдельных активных форм кислорода в спонтанную и активированную продукцию АФК
313 Ингибиторный анализ регуляции респираторного взрыва нейтрофилов
314 Оценка вклада рецепторов инициацию респираторного взрыва
315 Ингибирование киназ
316 Действие протеинкиназ тирфостина ФМЛФ с разным сродством в 51, ингибитора тирозиновых
317 Влияние GF109203Х, ингибитора протеинкиназы С
318 Действие SB 203508, ингибитора р38 МАРК
319 Действие вортманнина и LY294002, ингибиторов фосфатидилинозит-3-киназы
320 Влияние ортованадата натрия, ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз
321 Оценка количества и спектра белков периферических нейтрофилов
322 Роль синтеза белка в способности нейтрофилов продуцировать АФК
323 Количество и спектр белков в цитоплазматической и ядерной фракциях
324 Сравнение функциональной активности нейтрофилов на моделях солидных опухолей
Глава
IV Обсуяедение результатов
Выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение:
Актуальность проблемы. Выяснение взаимоотношений между иммунной системой и развивающейся в организме опухолью является актуальной и волнующей проблемой современной биологии клетки и онкоиммунологии. Иммунная система играет важную роль в задержке роста и регрессии опухолей [OBeime, Harrison, 2004; Mocellin, 2005]. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) вовлечены в развитие противоопухолевого иммунного ответа [Di Carlo et al,, 2001; Jablonska et al., 2005]. Они считаются важными при определенных видах противоопухолевой терапии [Chasseing et al., 1993; Castano et al., 2006]. Нейтрофилы подавляют рост экспериментальных опухолей in vivo [Fujii et al.,1987; Wang et al., 1989]. Нрямое цитостатическое и цитотоксическое действие нейтрофилов на опухолевые клетки подтверждено in vitro [Pericle et al., 1996; Igney et al., 2004]. Нейтрофилы первыми мигрируют к опухоли на ранних стадиях ее формирования [Stoppacciaro et al., 1993; Nakao et al., 2005] и являются активными компонентами стромы [Mueller, Fusenig, 2004]. Однако роль нейтрофилов, как и других клеток врожденного иммунитета, в возникновении и развитии опухолей неоднозначна [de Visser et al., 2006]. Показано, что на поздних стадиях инфильтрация опухоли нейтрофилами способствует прогрессу опухоли, усиливая ангиогенез и метастазирование с помощью селектинов [Borsig et al., 2002], цитокинов и ферментов [Nielsen et al., 1996; Wu et al., 2001; Sun, Yang, 2004]. Рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями основных звеньев иммунного ответа [Chen et al., 2003; Motta et al., 2003; Chang et al., 2004]. Имеются сведения о модуляции функций нейтрофилов при развитии опухоли: уменьшение хемотаксической активности, стимулированной формилированным пептидом [Ueta et al., 1994], возрастание либо понижение уровня продукции АФК [Чердынцева и др., 1992; Asian et al., 1998; Szuster-Ciesielska et al., 2004]. Однако сведения о влиянии опухоли на функциональную активность нейтрофилов противоречивы. Изменения зависят от типа, локализации и стадии онкологического заболевания [Kasimir-Bauer et al., 1994; Мальцева и др., 2005]. Цитотоксическая активность нейтрофилов опосредована протеолитическими ферментами гранул и активными формами кислорода (АФК). АФК продуцируются в респираторном взрыве, который инициируется активацией NADPH оксидазы [Babior, 2002; Segal, 2005]. Хемотаксический пептид N-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ) активирует респираторный взрыв, связываясь со специфическим рецептором [Thelen, 1993]. Показано, что в трансдукции сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу участвуют гетеротримерный Gi-белок, малые ГТФазы, протеинкиназа С (ПКС), каскад митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), фосфатидилинозит 3-киназа (ФИ-З-К) [Thelen, 1993; Hallett, Lloyds, 1997; Kyriakis, Avrach, 2001]. Ha данный момент остается малоизученным влияние опухоли и ее продуктов на активность и регуляцию NADPH оксидазы, ответственной за продукцию АФК. Этот вопрос является важным из-за двойственной роли АФК в организме. Они обеспечивают защиту от патогенов и трансформированных клеток, но и участвуют в мутагенезе, повреждая белки и нуклеиновые кислоты, и содействуют пролиферации опухолевых клеток [Zhang et al., 1998; Sapone et al., 2003; De Larco et al., 2004]. Для нормального функционирования организма важно поддержание оптимального уровня генерации АФК нейтрофилами, что обеспечивается внутриклеточных координированным сигнальных систем. взаимодействием Исследования компонентов внутриклеточной сигнализации широко проводятся на линиях культур клеток и на опухолевых клетках [Alessi et al., 1995; Droge et al., 2001; Dong-Yun et al., 2003; Patz et al., 2007]. Внутриклеточная сигнализация в периферических по отношению к опухоли клетках с высоким цитотоксическим потенциалом участниках врожденного иммунитета, в том числе в нейтрофилах, при росте опухоли в организме остается не исследованной. Возможно, именно на уровне передачи сигнала происходит модификация функционального поведения нейтрофилов таким образом, что они начинают способствовать росту опухоли. В целом участие нейтрофилов в процессах канцерогенеза на сегодняшний день мало изучено. Полученные в ходе данного исследования результаты помогут прояснить механизмы модификации клеток и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний. Цели и основные задачи исследования. Цель данной работы состояла в выявлении особенностей в генерации активных форм кислорода и ее регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo. Были поставлены следующие задачи: 1) разработать экспериментальные модели солидных опухолей из клеток карциномы Льюиса (LLC) на мышах линии C57BL/6; асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на мышах линии MNRI и культур J 774, WEHI 164, NSO на мышах линии BALB/c; 2) оценить параметры воспалительной реакции, такие как популяционный состав и количество перитонеальных воспалительных клеток; 3) охарактеризовать морфологические и функциональные свойства периферических нейтрофилов на разных сроках роста опухоли; 4) оценить спонтанную и вызванную продукцию АФК нейтрофилами животных с солидной опухолью на разных стадиях ее роста; 5) изучить роль рецепторов хемотаксического пептида ФМЛФ с высоким и низким сродством в инициации респираторного взрыва нейтрофилов мышей при росте опухоли; 6) исследовать внутриклеточную сигнализацию от рецепторов ФМЛФ на NADPH оксидазу с участием р38 МАРК, ГЖС и ФИ-З-К нейтрофилов мышей в динамике роста опухоли; 7) оценить спектр цитоплазматических и ядерных белков нейтрофилов при развитии опухоли в организме животного. Научная новизна. Впервые установлено, что развитие опухоли в организме животного сопровождается последовательным изменением морфологии и функциональной активности периферических нейтрофилов. Получены однозначные новые данные, свидетельствующие о том, что интенсивность респираторного взрыва периферических нейтрофилов и его регуляция меняется в динамике опухолевого процесса. Впервые показаны участие рецепторов ФМЛФ с разной аффинностью в инициации респираторного взрыва нейтрофилов на разных стадиях роста опухоли и модификация роли тирозиновых протеинкиназ, ПКС, р38 МАРК, ФИ-З-К в его регуляции. Впервые установлены общие закономерности изменения параметров воспалительной реакции при развитии солидных опухолей разной этиологии. Получены новые факты о характерных особенностях изменений продукции АФК и роли киназ в зависимости от типа опухоли и фазы ее развития. Результаты работы свидетельствуют о модификации периферических иммунных клеток во время роста опухоли. Научно-практическая ценность. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе модификации функциональной активности клеток иммунной системы, проблемам включая биологии нейтрофилы, клетки и относится к фундаментальным Полученные онкоиммунологии. представление о результаты существенно расширяют взаимоотношениях между клетками иммунной системы и растущей в организме опухолью. Считается, что важнейшей задачей современных исследователей в области онкологии является поиск новой стратегии в лечении онкологических заболеваний, которая будет основана в значительной степени на иммунотерапии, усиливающей противоопухолевый иммунитет и подавляющей процессы, которые способствуют развитию опухоли. Полученные в ходе данного исследования результаты помогают понять механизмы модификации клеток иммунной системы и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференция международная молодых конференциях и школах: 7-9 Пущинская (Пущино, 2003-2005); XV зимняя ученых молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003); FEBS Special Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003); отчетная годичная научная конференция ИБК РАН (Пущино, 2003); Physiological Society spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress" (Венгрия, 2003); Международный междисциплинарный Конгресс «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, 2004); III съезд биофизиков России (Воронеж, 2004); IX-XI Всероссийский научный фор) с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СанктПетербург, 2005-2007); 49* Annual Meeting of Biophysical Society (USA, 2005); 2-ая Международная конференция «Наука бизнес образование» (Пущино, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Научная школа-конференция «Сигнальные системы клетки: рецепторы, ионные каналы, вторичные мессенджеры физиологические функции и роль в онтогенезе» (биостанция Кропотово, Московская область, 2005); 2" World Conference of Stress (Венгрия, 2007); The EMBO/FEBS Advanced Lecture Course "Molecular mechanisms in signal transduction and cancer" (Греция, 2007). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 статьи (1 статья в печати).Список сокращений: АГ антиген; АКЭ асцитная карцинома Эрлиха; АО акридиновый оранжевый; АФК активные формы кислорода; АФП а-фетопротеин; ИЛ интерлейкины; ИНФ интерфероны; МАРК kinases); МИФ макрофаг-ингибирующий фактор; м н е главный комплекс гистосовместимости; ОАА онухоль-ассоциированные антигены; 0 3 опсонизированный зимозан; ОС окислительный стресс; ПКС протеинкиназа С; СОД супероксиддисмутаза; ФИ-З-К фосфатидилинозит 3-киназа; ФЛС фосфолипаза С; ФМЛФ N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; ФНО фактор некроза опухоли; ХЛ хемилюминесценция; ERK киназы регулируемые внеклеточными сигналами (extracelluler signalregulated kinases); HLA антигены лейкоцитов человека (human-leucocyte-associated antigens); JNK c-Jun киназа; LLC карцинома Льюиса (Lewis Lung Carcinoma); NADPH никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; NK натуральные киллерные клетки; t-boc-МЛФ Л-терт-бутоксикарбонил-Мет-Лей-Фен; TCR Т-клеточный рецептор; TGF фактор роста тромбоцитов. митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein
